روش سنگر (Sanger Sequencing) یا روش پایان زنجیره یکی از دقیقترین و قدیمیترین روشهای تعیین توالی DNA است که توسط فردریک سنگر در سال ۱۹۷۷ معرفی شد. این روش برای سالها به عنوان «استاندارد طلایی» تعیین توالی ژنتیکی شناخته میشد.
اساس روش سنگر
روش سنگر بر پایه توقف تصادفی سنتز DNA توسط دیاکسینوکلئوتیدهای ترمیناتور (ddNTPs) است. این نوکلئوتیدها فاقد گروه 3’-OH هستند، بنابراین پس از ورود آنها به رشته DNA، سنتز متوقف میشود.
مراحل اصلی روش سنگر:
۱-آمادهسازی واکنش
در یک لولهی واکنش (یا چهار لولهی جداگانه در نسخه کلاسیک)، موارد زیر قرار میگیرد:
۱-رشته DNA قالب (template)، ۲– پرایمر تکرشتهای (برای شروع سنتز)، ۳-DNAپلیمراز، ۴-مخلوطی از dNTPs (نوکلئوتیدهای معمولی)، ۵-مقدار کم از ddNTPs نشاندار (با فلورسانس یا رادیواکتیو)
۲-سنتز DNA و توقف تصادفی
- DNA پلیمراز شروع به سنتز رشته مکمل میکند.
- هرگاه یک ddNTP وارد شود، سنتز متوقف میشود.
- در نتیجه مخلوطی از قطعات DNA با طولهای مختلف تولید میشود که هرکدام در انتهای خود یک ddNTP خاص دارند.
۳-الکتروفورز مویرگی (Capillary Electrophoresis)
- قطعات DNA سنتز شده با توجه به اندازه از هم جدا میشوند.
- دستگاه توالییاب، سیگنال فلورسانس انتهای قطعات را ثبت میکند و ترتیب بازها را مشخص میسازد.
مزایا:
- دقت بالا (حدود ۹۹.۹٪)
- مناسب برای توالیهای کوتاه تا متوسط (حدود ۵۰۰–۱۰۰۰ نوکلئوتید)
- به خوبی برای تأیید نتایج NGS به کار میرود
معایب:
- پرهزینه و زمانبر برای پروژههای با حجم زیاد
- کارایی پایین در مقایسه با روشهای نسل جدید
مکانیسم کامل روش سنگر
مکانیسم روش سنگر سِکوئنسینگ (Sanger Sequencing) بر پایهی مداخله کنترلشده در سنتز DNA توسط دیاکسینوکلئوتیدهای ترمیناتور (ddNTPs) است که باعث توقف زنجیره میشوند.
۱-آغاز سنتز DNA
- یک رشته DNA تکرشتهای الگو (template) استفاده میشود.
- به این رشته، پرایمر اختصاصی اضافه میشود تا به ناحیهای خاص از DNA متصل شود و شروع سنتز را ممکن کند.
- آنزیم DNA پلیمراز سنتز رشته مکمل را آغاز میکند.
۲-مخلوط شدن dNTP و ddNTP
- در واکنش، ۴ نوکلئوتید طبیعی (dATP، dTTP، dCTP، dGTP) به همراه مقدار کمی از ۴ ddNTP (دیاکسینوکلئوتید) علامتگذاریشده وجود دارد.
- این ddNTPها فاقد گروه 3’-OH هستند.
۳-ادامه سنتز تا ورود ddNTP
- DNA پلیمراز رشته مکمل را تا زمانی که یک ddNTP بهطور تصادفی وارد شود، سنتز میکند.
- با ورود ddNTP به زنجیره، به دلیل نبود گروه 3’-OH، دیگر نوکلئوتید جدیدی نمیتواند اضافه شود و سنتز متوقف میشود.
۴-ایجاد مجموعهای از قطعات DNA
- در واکنش، رشتههای DNA با طولهای مختلف تولید میشود، که هرکدام در محل خاصی (وابسته به جایگاه ورود ddNTP) خاتمه یافتهاند.
- هر قطعه، با یک باز مشخص در انتها (A, T, G یا C) پایان یافته است و با یک رنگ فلورسانس خاص علامتگذاری شده است.
۵-تفکیک قطعات با الکتروفورز مویرگی
- قطعات DNA به وسیلهی الکتروفورز مویرگی بر اساس اندازه تفکیک میشوند (قطعات کوچکتر سریعتر حرکت میکنند).
- انتهای هر قطعه دارای فلوروفور (رنگ فلورسانس) است که دستگاه آن را شناسایی میکند.
۶-تعیین توالی
- دستگاه سیگنال فلورسانس را ثبت میکند و بر اساس رنگ هر سیگنال، بازهای انتهایی را مشخص میسازد.
- با کنار هم قرار دادن این بازها (از کوچکترین قطعه تا بزرگترین)، توالی کامل DNA مشخص میشود.
- خروجی بهصورت یک کروماتوگرام رنگی است که پیک هر رنگ نشاندهنده یکی از نوکلئوتیدها (A، T، G، C) در توالی میباشد.
نقد و بررسیها
هنوز بررسیای ثبت نشده است.